2、连接酶只作用于双链DNA，在彼此相邻的核苷酸之间产生3'，5'磷酸二酯键。连接缺口DNA的最佳反应温度是37℃。但是在这个温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的。因此，连接粘性末端的最佳温度，应是界于连接酶作用速率和粘性末端结合速率之间，一般认为４－１５℃比较合适。
3、理想的质粒运载体，应具备以下几个条件：
(1) 能自主复制
(2) 具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能；
(3) 在基因组中有多个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征。
